Bordetella Pertussis Nucleic Acid Detection Kit (Fluorescent PCR)

A1: (1) プライマー 人工合成プライマーが不適切な保存条件により分解していないか確認する；プライマー設計が合理的かどうか、BLASTを使用してプライマー特異性を確認するか、プライマーを再設計する。(2) テンプレート 長期保存や繰り返しの凍結融解により、テンプレートが切断、開環、または分解する可能性がある。新鮮に調製したDNA二本鎖をテンプレートとして使用する；テンプレートのGC含量が高すぎると、二本鎖DNAが開かなくなる。その場合、PCR Enhancer（品番P021）を添加することで、解離温度を効果的に下げることができる；テンプレートがcDNAの場合、逆転写に使用したRNAの純度と完全性を確認する必要がある。(3) 酵素 反応に使用する酵素が不適切な保存または輸送により失活している。新しい酵素に交換するか、別の由来の酵素で再実験することを推奨する。(4) 増幅系 反応系の構成が正しくない場合、実験を繰り返すことを推奨する。(5) 反応プログラム 変性温度が正確かどうか、PCR装置の表示温度が実際の温度と一致しているかを確認する。温度が高すぎると、最初の数サイクルで酵素が急速に失活する。一方、温度が低すぎると、テンプレートの変性が不完全になる；アニーリング温度が適切でない。アニーリング温度にグラジエントを設定して適切な温度を探索する；プライマーのTm値に基づいてアニーリング温度を設定する。例えば、プライマーTm値≥72℃の場合、アニーリングステップを削除し、その後の伸長ステップ（2ステップPCR）を直接実行できる。

A2: (1) プライマー 人工合成プライマーが分解していないか確認する。(2) テンプレート まずテンプレートの品質を確認する。長期保存や繰り返しの凍結融解により、テンプレートが切断、開環、または分解する可能性がある。新鮮に調製したDNA二本鎖をテンプレートとして使用する；テンプレートがない場合は、初回増幅産物を倍数希釈して、それをテンプレートとして二次増幅を行うことができる。(3) 反応プログラム Touch Downプログラムを試す；伸長時間を延長し、サイクル数を増やす。