HPV 核酸検出および16/18型判定キット（蛍光PCR）

A1: （1）プライマー 人工合成されたプライマーが不適切な保存条件により分解されていないか確認してください。プライマー設計が適切かどうか、BLASTを使用してプライマーの特異性をチェックするか、プライマーを再設計してください。 （2）鋳型 長期保存や繰り返しの凍結融解により、鋳型の切断、環状の開裂、または分解が生じる可能性があります。新鮮に調製した二本鎖DNAを鋳型として使用してください。鋳型のGC含量が高いと、二本鎖DNAが解離できなくなることがあります。この場合、PCR Enhancer（製品番号P021）を添加することで効果的に解離温度を下げることができます。鋳型がcDNAの場合、逆転写に使用したRNAの純度と完全性を確認してください。 （3）酵素 保存や輸送が不適切だったために反応に使用する酵素が失活していることがあります。新しい酵素に交換するか、別の供給元の酵素で再実験することをお勧めします。 （4）増幅系 反応系の構成が誤っている可能性があるため、実験を繰り返すことをお勧めします。 （5）反応プログラム 変性温度が正確かどうか、PCR装置の表示温度と実際の温度が一致しているかどうかを確認してください。温度が高すぎると、最初の数サイクルで酵素が急速に失活し、低すぎると鋳型の変性が不完全になります。アニーリング温度が適切でない場合は、グラディエントを設定して適切なアニーリング温度を検討してください。プライマーのTm値に基づいてアニーリング温度を設定します。例えば、プライマーTm値が72℃以上の場合は、アニーリングステップを省略し、そのまま伸長ステップ（2ステップPCR）に進むことができます。

A2: （1）プライマー 人工合成されたプライマーが分解されていないか確認してください。 （2）鋳型 まず鋳型の品質を確認してください。長期保存や繰り返しの凍結融解により、鋳型の切断、環状の開裂、または分解が生じる可能性があります。新鮮に調製した二本鎖DNAを鋳型として使用してください。鋳型が乏しい場合は、最初の増幅産物を段階希釈して二次増幅の鋳型として使用することができます。 （3）反応プログラム タッチダウンプログラムを試すことができます。伸長時間を延長し、サイクル数を増やしてください。