NPAs-9600

A1: (1) プライマー 人工合成プライマーが不適切な保存条件により分解していないか確認します。プライマー設計が適切かどうか、BLASTを用いてプライマーの特異性を確認するか、プライマーを再設計します。 (2) テンプレート 長期保存や繰り返しの凍結融解により、テンプレートの切断、開環、分解が起こる可能性があります。新調製したDNA二本鎖をテンプレートとして使用してください。テンプレートのGC含量が高すぎると二本鎖DNAが開裂できない場合があります。その際はPCR Enhancer（品番P021）を添加することで効果的に変性温度を下げることができます。テンプレートがcDNAの場合、逆転写に使用したRNAの純度と完全性を確認する必要があります。 (3) 酵素 反応に使用する酵素が不適切な保存や輸送により失活している場合があります。新しい酵素に交換するか、別の供給元の酵素で再実験することを推奨します。 (4) 増幅システム 反応液の調製が誤っている場合は、実験を繰り返すことを推奨します。 (5) 反応プログラム 変性温度が正確か、PCR装置の表示温度と実際の温度が一致しているか確認します。温度が高すぎると最初の数サイクルで酵素が急速に失活し、低すぎるとテンプレート変性が不完全になります。アニーリング温度が適切でない場合、グラジエント機能を用いて適切なアニーリング温度を検討します。プライマーのTm値に基づいてアニーリング温度を設定します。例えばプライマーTm値が72℃以上の場合は、アニーリングステップを省き、後続の伸長ステップ（2ステップPCR）に直接進むことも可能です。

A2: (1) プライマー 人工合成プライマーが分解していないか確認します。 (2) テンプレート まずテンプレートの品質を確認します。長期保存や繰り返しの凍結融解により、テンプレートの切断、開環、分解が起こる可能性があります。新調製したDNA二本鎖をテンプレートとして使用してください。テンプレートが入手できない場合は、最初の増幅産物を段階希釈して二次増幅のテンプレートとして使用することも可能です。 (3) 反応プログラム タッチダウンプログラムの使用を試みてください。伸長時間を延長し、サイクル数を増やします。