B群溶血性連鎖球菌核酸検出キット（蛍光PCR法）

A1: (1) プライマー 人工合成したプライマーが不適切な保存条件により分解していないか確認します。プライマー設計が妥当かどうか、BLASTで特異性をチェックするか、プライマーを再設計します。 (2) テンプレート 長期保存や凍結融解の繰り返しにより、テンプレートの切断、開環、分解が起こることがあります。テンプレートには新しく調製したDNA二本鎖を使用します。テンプレートのGC含量が高すぎると二本鎖DNAが開かなくなるため、PCRエンハンサー（製品番号P021）を添加することで効果的に巻き戻し温度を下げられます。テンプレートがcDNAの場合は、逆転写に使用したRNAの純度と完全性を確認する必要があります。 (3) 酵素 保存や輸送時の不備により反応に使用する酵素が失活している場合は、新しい酵素に交換するか、別の供給元の酵素で再実験することを推奨します。 (4) 増幅系 反応系の調製が誤っている可能性があるため、再実験を推奨します。 (5) 反応プログラム 変性温度が正確か、PCR装置の表示温度と実際の温度が一致しているか確認します。温度が高すぎると最初の数サイクルで酵素が急速に失活し、低すぎるとテンプレートの変性が不完全になります。アニーリング温度が適切でない場合は、グラジエントを設定して適切なアニーリング温度を検討します。プライマーのTm値が72℃以上の場合は、アニーリングステップを省略し、その後の伸長ステップに直接進む2ステップPCRを行うことができます。

A2: (1) プライマー 人工合成したプライマーが分解していないか確認します。 (2) テンプレート まずテンプレートの品質を確認します。長期保存や凍結融解の繰り返しにより、テンプレートの切断、開環、分解が起こることがあります。テンプレートには新しく調製したDNA二本鎖を使用します。テンプレートが得られない場合は、初回増幅産物を段階希釈し、二次増幅のテンプレートとして使用します。 (3) 反応プログラム タッチダウンプログラムを試すことができます。伸長時間を延長し、サイクル数を増やします。