Human Parainfluenza Virus Type 1, Type 2, Type 3 Nucleic Acid Detection Kit (Fluorescent PCR)

A1: （1）プライマー 人工合成プライマーが不適切な保存条件により分解されていないか確認します。プライマー設計が適切かどうか、BLASTを用いてプライマー特異性を確認するか、プライマーを再設計します。（2）テンプレート 長期保存や繰り返しの凍結融解によりテンプレートの切断、開環、分解が起こることがあります。新たに調製したDNA二本鎖をテンプレートとして使用してください。テンプレートのGC含量が高すぎると二本鎖DNAが開裂しにくくなります。この場合、PCRエンハンサー（製品番号P021）を添加すると効果的に融解温度を下げることができます。テンプレートがcDNAの場合は、逆転写に用いたRNAの純度と完全性を確認する必要があります。（3）酵素 反応に使用する酵素が不適切な保存や輸送により失活している場合があります。新しい酵素に交換するか、別の供給元の酵素で再実験することをお勧めします。（4）増幅系 反応系の調製に誤りがある場合、実験を繰り返すことを推奨します。（5）反応プログラム 変性温度が正確か、PCR装置の表示温度と実際の温度が一致しているか確認します。温度が高すぎると酵素が最初の数サイクルで急速に失活し、低すぎるとテンプレートの変性が不完全になります。アニーリング温度が適切でない場合は、アニーリング温度に勾配を設けて適切な温度を探索します。プライマーのTm値に基づいてアニーリング温度を設定します。例えばプライマーTm値が72℃以上の場合は、アニーリングステップを省略し、後続の伸長ステップ（2ステップPCR）に直接進むことも可能です。

A2: （1）プライマー 人工合成プライマーが分解されていないか確認します。（2）テンプレート まずテンプレートの品質を確認します。長期保存や繰り返しの凍結融解によりテンプレートの切断、開環、分解が起こることがあります。新たに調製したDNA二本鎖をテンプレートとして使用してください。テンプレートが得られない場合は、最初の増幅産物を段階希釈して二次増幅のテンプレートとして使用することもできます。（3）反応プログラム タッチダウンプログラムを試すことも可能です。伸長時間を延長し、サイクル数を増やします。