SARS-COV-2 核酸検出キット（蛍光RT-PCR）

A1: （1）プライマー 人工合成プライマーが不適切な保存条件により分解していないか確認する。プライマー設計が適切かどうか、BLASTを用いてプライマーの特異性を確認するか、プライマーを再設計する。 （2）鋳型 長期保存や繰り返しの凍結融解は鋳型の切断、開環、または分解を引き起こす可能性がある。新たに調製したDNA二本鎖を鋳型として使用すること。鋳型のGC含量が高すぎると二本鎖DNAが開裂できなくなる。その場合、PCR Enhancer（品番P021）を添加することで効果的に巻き戻し温度を下げることができる。鋳型がcDNAの場合、逆転写に使用したRNAの純度と完全性を確認する必要がある。 （3）酵素 反応に使用する酵素が不適切な保存や輸送により失活している可能性がある。新しい酵素に交換するか、別の供給元の酵素で再実験することを推奨する。 （4）増幅システム 反応系の構成が誤っている可能性があるため、再実験を推奨する。 （5）反応プログラム 変性温度が正確かどうか、PCR装置の表示温度と実際の温度が一致しているか確認する。温度が高すぎると最初の数サイクルで酵素が急速に失活し、低すぎると鋳型の変性が不完全になる。アニーリング温度が適切でない場合は、勾配を設定して適切なアニーリング温度を探索する。プライマーTm値が72℃以上の場合はアニーリングステップを省略し、直接その後の伸長ステップ（2ステップPCR）に進むことができる。

A2: （1）プライマー 人工合成プライマーが分解していないか確認する。 （2）鋳型 まず鋳型の品質を確認する。長期保存や繰り返しの凍結融解は鋳型の切断、開環、または分解を引き起こす可能性がある。新たに調製したDNA二本鎖を鋳型として使用すること。鋳型が利用できない場合、最初の増幅産物を段階希釈して二次増幅の鋳型として使用できる。 （3）反応プログラム タッチダウンプログラムを試すことができる。伸長時間を延長し、サイクル数を増やす。